實(shí)驗室常用微生物菌種的分離和純化方法

混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應用中，不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養物的“純潔”，防止其他微生物的混入。

1、用固體培養基分離和純化

單個(gè)微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長(cháng)、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結構的子細胞生長(cháng)群體，稱(chēng)為菌落。當固體培養基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔。不同微生物在特定培養基上生長(cháng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩定的特征，可以成為對該微生物進(jìn)行分類(lèi)、鑒定的重要依據。大多數**、酵母菌、以及許多**和單細胞藻類(lèi)能在固體培養基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養。所謂平板，即培養平板的簡(jiǎn)稱(chēng)，它是指固體培養基倒入無(wú)菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養基的平皿。這方法包括將單個(gè)微生物分離和固定在固體培養基表面或里面。固體培養基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養基，每個(gè)孤立的活微生物體生長(cháng)、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。*常用的分離、培養微生物的固體培養基是瓊脂固體培養基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養的技術(shù)簡(jiǎn)便易行，100多年來(lái)一直是各種菌種分離的*常用手段。

1.1 稀釋倒平板法

首先把微生物懸液作一系列的稀釋?zhuān)ㄈ?:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左 右的瓊脂培養基混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時(shí)間即可出現菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)**細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復以上操作數次，便可得到純培養。

1.2 涂布平板法

因為將微生物懸液先加到較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會(huì )使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(cháng)，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養后挑取單個(gè)菌落

2、用液體培養基分離和純化

大多數**和**，用平板法分離通常是滿(mǎn)意的，因為它們的大多數種類(lèi)在固體培養基上長(cháng)得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養基上生長(cháng)，例如一些細胞大的**、許多原生動(dòng)物和藻類(lèi)等，這些微生物仍需要用液體培養基分離來(lái)獲得純培養。

稀釋法是液體培養基分離純化常用的方法。接種物在液體培養基中進(jìn)行順序稀釋?zhuān)缘玫礁叨认♂尩男Ч?，使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數試管中沒(méi)有微生物生長(cháng)，那么有微生物生長(cháng)的試管得到的培養物可能就是純培養物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長(cháng)的比例提高了，得到純培養物的機率就會(huì )急劇下降。因此，采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數（一般應超過(guò)95%）表現為不生長(cháng)。

3、單細胞（孢子）分離

只能分離出混雜微生物群體中占數量?jì)?yōu)勢的種類(lèi)是稀釋法的一個(gè)重要缺點(diǎn)。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數。這時(shí)，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養以獲得純培養，稱(chēng)為單細胞（或單孢子）分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類(lèi)、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的**則較難。

較大的微生物，可采用毛細管提取單個(gè)個(gè)體，并在大量的**培養基中轉移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進(jìn)行。對于個(gè)體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細胞或孢子以獲得純培養。在沒(méi)有顯微操作儀時(shí)，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進(jìn)行單細胞分離，例如將經(jīng)適當稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀(guān)察，選取只含一個(gè)細胞的液體來(lái)進(jìn)行純培養物的分離。單細胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專(zhuān)業(yè)化的科學(xué)研究中采用。